Szent Ambrus püspök a IV. században bevezette egyháza liturgiájába az antifonális zsoltáréneklést és a himnuszokat a zsolozsma folyamán. A görög nyelvű liturgikus szövegeket megszüntette, és mindegyiket latinokkal helyettesítette, hogy ezáltal megakadályozza az ariánus eretnekséget tartalmazó imák, énekek beszüremkedését. Szent Ágoston kérdésére kifejtette Milánó saját böjti szokásai kapcsán: Amikor Rómában vagyok, böjtölök szombaton, itt pedig nem. Te is így tegyél, amikor valamelyik egyházban tartózkodsz, kövesd annak törvényeit, hogy senkit meg ne botránkoztass. Később majd Szent Ágoston is mestere tanácsát adja híveinek: minden egyház a maga szokásait kövesse, és ne szóljon bele a másokéba. A levélváltásból is kiderül, hogy Milánónak már a IV. században sok jellegzetes liturgikus szokása volt, ha nem is rendeződtek ezek a mai értelemben vett liturgikus családdá.
A VII. század végén, a szír I. Sergius pápa uralkodása alatt Pávia görög püspöke hatására Észak-Itáliában sok keleti szokás, szöveg, ünnep honosodott meg, mint például az antiochiai Szent Babila tisztelete (ősi temploma ma is áll Milánóban). Milánó városa olyan szertartásokat is átvett, mint a mise végén az eucharisztia elhelyezése, az ünnepek matutínumának keresztes körmenete és a hívek két szín alatti áldoztatása bemártással.
Az ambrozián liturgia első szövegeinek összeállítása az V. század második felére tehető, majd ezek – a fent említett keleti befolyás alatt – a VII. században jelentősen bővültek (százharminc miseénekkel és kétszázharminc zsolozsma tétellel), valamint az éneklés ritmusát is pontosították.
A legkorábbi ismert ambrozián szakramentárium a IX. századból való, ennek ellenére az első évezredben gazdag és mozgalmas liturgikus élet nyomait követhetjük nyomon Milánóban.
